Test imunofluorescencije

Cilj imunofluorescentne tehnike je učiniti protutijelo vidljivim tako što se veže s nekom fluorescentnom tvari (npr. fluoresceinizotiocijanat – FITC, rodamin, fikoeritrin). Postoji direktna i indirektna imunofluorescentna tehnika. Kao što same riječi kažu u direktnoj imunofluorescenciji, obilježena su ona protutijela koja prepoznaju ciljni antigen odnosno stanicu koju tražimo, dok su u indirektnoj imunofluorescentnoj tehnici primarna protutijela neobilježena, a njihovo se vezanje za ciljne antigene (stanice) učini vidljivim pomoću sekundarnih protutijela (protu-protutijela) koja su obilježena s fluorescentnom tvari. Osnovna odlika direktne imunofluorescencije je velika specifičnost, ali je obično slabija od intenziteta indirektne fluorescencije.

Indirektna imunofluorescencija

Na ciljnim stanicama nalaze se dva sloja protutijela. Prvi sloj čine neobilježena protutijela vezana na ciljni antigen na limfocitima (npr CD4 antigen), dok drugi sloj čine obilježena protu-protutijela, koja omogućuju vizualizaciju vezanja prvih protutijela na limfocite. Da bi se isključilo nespecifično vezanje primarnih protutijela na stanice kao kontrola koriste se irelevantna protutijela istog razreda. Druga kontrola u koju nisu dodavana primarna protutijela služi za kontrolu sekundarnih protutijela u smislu križne reaktivnosti ili nespecifičnog vezanja na stanice.

Direktna imunofluorescencija

Postupak direktne fluorescencije pomoću antiseruma specifičnih za ljudske imunoglobuline omogućuje određivanje udjela stanica s membranskim imunoglobulinima (limfociti B) u mješanoj populaciji limfocita perifeme krvi. Za razliku od indirektne fluorescencije pomoću obilježenih monoklonskih protutijela usmjerenih na različite antigenske biljege (osim imunoglobulina) na limfocitima T i B, prikazana metoda obično rezultira veoma jakim intenzitetom fluorescencije. Razlog tome je veliki broj veznih mjesta na imunoglobulinima na membrani, te činjenica da se u antiserumu nalaze protutijela koja prepoznaju različite antigenske determinante na imunoglobulinima što povećava koncentraciju obilježenih protutijela na membrani.